معرفی دو تکنیک مولکولی Digital PCR و Real time PCR

تکنیک های مولکولی شامل روش های مختلفی مانند مدلسازی مولکولی، داکینگ مولکولی،PCR، ریل تایمPCR، بلوتینگ، الکتروفورز، هیبریدیزاسیون، کلونینگ، توالی یابی و سایر روش های آزمایشگاهی و محاسباتی است. تکنیک های مولکولی، اهمیت زیادی در بررسی تغییرات ژنتیکی، تشخیص بیماریها، طراحی داروها، بررسی میزان بیان ژنها، شناسایی مولکولهای نادر و سایر کاربردهای بالینی و صنعتی دارند.

تکنیک های مولکولی Digital PCRوReal time PCR

تکنیک های مولکولیDigital PCRوReal time PCRدو روش پیشرفته برای تشخیص و اندازه گیری کمی اسیدهای نوکلئیک هستند که در بسیاری از زمینه های علمی و پزشکی کاربرد دارند. این دو روش از متد پایهPCRاستفاده میکنند، اما با این تفاوت کهDigitalPCRنمونه را به قسمت های کوچکتر تقسیم میکند و تعداد مولکول های هدف را به صورت مطلق برآورد میکند، در حالی کهReal timePCRفلورسانس ایجاد شده توسط مولکول های گزارشگر را در طول واکنش اندازه گیری میکند و تعداد مولکول های هدف را به صورت نسبی محاسبه میکند.

دستگاه دیجیتال  pcrمیتواند برای تشخیص موتاسیونهای نقطهای، تعیین تعداد کپی ژن، تفکیک ژنومهای مختلف و تشخیص آلودگیهای میکروبی مفید باشد.real time pcrمیتواند برای تشخیص ویروسها، باکتریها، قارچها، پروتوزوآها، تعیین میزان ویروسهای خونی، تشخیص سرطانها، تعیین میزان بیان ژنها و سایر کاربردهای تشخیصی و تحقیقاتی مفید باشد.

تاریخچهqPCR Top of Form

تاریخچه سیستم‌هایPCR(واکنش زنجیره‌ای پلیمراز)، که به عنوانPCRکمی(qPCR)نیز شناخته می‌شود، سفری جذاب از نوآوری علمی و پیشرفت فناوری است. PCRزمان واقعی به یک تکنیک اساسی در بیولوژی مولکولی برای کمیت‌سنجیDNAوRNAتبدیل شده است. در اینجا یک بررسی اجمالی ارائه شده است:

اولین تلاش‌ها برای کمیت‌سنجی محصولاتPCRشامل اجرای محصولاتPCRدر ژل‌ها و رنگ‌آمیزی آن‌ها بود، فرآیندی که دشوار و نه چندان کمی بود.دهه ۱۹۹۰ شاهد معرفی رنگ‌ها و پروب‌های فلورسنت درPCRبود که پایه‌گذاری برای ریل تایمPCR بود. این رنگ‌ها و پروب‌ها در حضور محصولاتPCRفلورسنس ایجاد می‌کنند و اجازه کمیت‌سنجی را می‌دهند.

نوآوری کلیدی، توسعه سایکلرهای حرارتی مجهز به قابلیت‌های تشخیص فلورسنس بود. این امر به محققان اجازه داد تا فرآیندPCRرا به صورت زمان واقعی رصد کنند.در اواخر دهه ۱۹۹۰، اولین سیستم‌های تجاری  PCR زمان واقعی در دسترس قرار گرفتند. شرکت‌هایی مانندApplied BiosystemsوRocheنقش‌های مهمی در توسعه و بازاریابی این سیستم‌ها داشتند.علاوه بر سخت‌افزار، نرم‌افزار پیشرفته‌ای برای تحلیل داده‌ها و تفسیر توسعه یافت کهqPCRرا قابل دسترسی‌تر و کاربرپسندتر کرد.پیشرفت های مداوم در فناوریPCRزمان واقعی شامل توسعه دستگاه‌های سریع‌تر، قابل اعتمادتر و حساس‌تر بود.

تکنیک ریل تایم PCR

تکنیک ریل تایمPCR یک روش مدرن و پیشرفته برای تشخیص و سنجش میزان بیان ژن ها در نمونه های بیولوژیکی است. این روش با استفاده از نشانگرهای فلورسنت و دستگاه ریل تایم PCR قادر است به تفکیک و شناساییDNAهای مختلف در یک واکنشPCRبپردازد. این تکنیک کاربردهای متعدد و متنوعی در تحقیقات علوم زیستی دارد که از جمله آنها میتوان به موارد زیر اشاره کرد:

  •بررسی بیان ژن

• کاربردهای تشخیصی (بیماری های ژنتیکی و عفونی)

• تشخیص ارگانیسم های اصلاح شده ژنتیکی

• کمی سازی و ژنوتایپ بالینی

دستگاه ریل تایمPCR

دستگاه های ریل تایمPCR، دستگاه هایی هستند که برای اندازه گیری مقدارDNAیاRNAهدف در نمونه های مختلف استفاده میشوند. این دستگاه ها با استفاده از یک مولکول گزارشگر فلورسنت، میزان تکثیرDNAیاRNAرا در هر چرخه واکنش اندازه گیری میکنند و نتایج را به صورت گرافیکی نشان میدهند. این دستگاه ها دقت، حساسیت، سرعت و خودکار بودن بالاتری نسبت بهPCRساده دارند و کاربردهای زیادی در تشخیص بالینی، تحقیقات ژنتیک، بیوتکنولوژی و زیست شناسی مولکولی دارند.

این دستگاه ها، ظرفیت بالا (۹۶ یا ۳۸۴ چاهک) دارند و قادر به انجام چندین واکنشPCRبه صورت همزمان هستند. این دستگاه ها مولتی پلکسینگ و نرم افزار تحلیل داده را دارند. این دستگاه ها پیشرفته، کارآمد و مناسب برای تحقیقات ژنومیک، پروتئومیک و ترانسکریپتومیک هستند. از جمله این دستگاه هاRotorgene Q، Step One Plus است.جهت خرید…..

تاریخچه تکنیکdPCR

تاریخچه سیستم‌هایPCRدیجیتال(dPCR)به اوایل دهه ۱۹۹۰ بازمی‌گردد و نقاط عطف مهمی را در زمینه بیولوژی مولکولی نشان می‌دهد.PCRدیجیتال نماینده پیشرفت قابل توجهی در دقت و حساسیت کمیت‌سنجیDNA است. مفهومdPCRاولین بار در سال ۱۹۹۲ توسط دکتر برت واگلشتاین و دکتر کنت کینزلر توصیف شد. آنها روشی برای کمیت‌سنجی مطلق اسیدهای نوکلئیک با تقسیم‌بندی نمونه به تعداد زیادی واکنش‌هایPCRمجزا پیشنهاد کردند.

توسعه اولین سیستم‌هایdPCRدر اواخر دهه ۱۹۹۰ آغاز شد. این سیستم‌ها برای تقسیم‌بندی نمونه‌ها به واحدهای مجزا طراحی شدند که در آن‌ها واکنش‌هایPCRمی‌توانستند به صورت مستقل رخ دهند.

اوایل دهه ۲۰۰۰ شاهد پیشرفت ‌های قابل توجهی در فناوریdPCRبود. این دوره نشان‌دهنده توسعه تکنیک‌های پیشرفته ای مانند تراشه‌های میکروفلوئیدیک و سیستم‌های مبتنی بر قطره بود.اولین سیستم‌های تجاریdPCRدر اوایل دهه ۲۰۱۰ معرفی شدند. شرکت‌هایی مانند بایو-رد و رین‌دنس تکنولوژیز از پیشگامان در عرضه سیستم‌هایdPCRبه بازار بودند.

با پیشرفت‌های حاصله، سیستم‌هایdPCRکاربرپسندتر، قابل اعتمادتر و قادر به تحلیل با ظرفیت بالا شدند. این منجر به پذیرش گسترده آنها در زمینه‌های مختلفی مانند انکولوژی، بیماری‌های عفونی و تحقیقات ژنتیکی شد.سال‌های اخیر شاهد نوآوری مداوم در فناوریdPCRبوده‌اند، با پیشرفت هایی در حساسیت، دقت و ظرفیت دستگاه ها. اکنونdPCRدر انجام بیوپسی مایع برای تشخیص سرطان، نظارت بر موجودات دستکاری شده ژنتیکی(GMO(ها و اندازه‌گیری دقیق‌تر نتایج ویرایش ژن نیز استفاده می‌شود.

تاریخچهdPCRگواهی بر تکامل سریع تکنیک‌های بیولوژی مولکولی است، که نشان‌دهنده پیشرفت‌های مداوم در دقت، خودکارسازی و تحلیل داده‌ها می‌باشد. این فناوری همچنان در حال تکامل است و وعده دیدگاه‌های بیشتری در تحلیل ژنتیکی و مولکولی را می‌دهد.

پروسه و فرایند دیجیتالPCR

 PCRدیجیتال نسل جدیدی ازPCRکمی (qPCR)است که برای کمی‌سازی مطلق اسیدهای نوکلئیک هدف استفاده می‌شود. در یک آزمایش دیجیتال، نمونه به چندین بیوراکتور کوچک تقسیم می‌شود، که هر کدام از آن‌ها صفر یا یک یا دو (یا سه، چهار و غیره) نسخه از اسیدهای نوکلئیک هدف را دارند. هر قطره دارای یک منطقه بسته‌بندی شده خاص است که از آلودگی متقابل بین بیوراکتورهای کوچک جلوگیری می‌کند.

 چندین روش برای تقسیم نمونه‌ها توسعه یافته است، از جمله فرمت‌های میکرووِل، چیپ ‌های میکروفلوئیدیک و قطره‌ای. میکروفلوئیدیک می‌تواند میلیون‌ها بیوراکتور کوچک را به شیوه‌ای ‌کارآمد ایجاد کند. دیجیتالPCR مبتنی بر قطره(ddPCR)نوعی ازPCRدیجیتال است که از یک سیال ناسازگار (یعنی سیال پراکنده) در روغن (یعنی سیال پیوسته) برای تولید قطره‌های زیرمیکرولیتری با نرخ‌های کیلوهرتز استفاده می‌کند.

 اسیدهای نوکلئیک مانندDNA، RNAوDNAمکمل(cDNA)ممکن است به طور اتفاقی در داخل قطره‌ ها به عنوان اتاقک‌های واکنش بسته‌بندی شوند. درصد کمی از قطره ‌ها یک یا کمتر از یک نسخه از قالبDNAرا دارند (بسیاری از قطره‌ها هیچ یک ازDNAهدف را ندارند) و سپس در هر میکروقطره به صورت کلونی تقویت می‌شوند. پس از تقویتPCRمعمولی، غلظت‌ها بر اساس نسبت بخش‌های غیرفلورسنت با توزیع پوآسون تعیین می‌شوند.

مقایسه تکنیکDroplet digital PCRباconventional qPCR

 PCRدیجیتال مبتنی بر قطره(ddPCR)مزایای زیادی نسبت به روش‌هایPCRکمی سنتی(qPCR)دارد. در روشqPCR، امپلیکان‌ها در پایان هر مرحله با استفاده از رنگ‌های متصل بهDNAمحاسبه می‌شوند. شدت رنگ‌های فلورسنت متصل بهDNAدو رشته‌ای متناسب با آمپلیکان‌هایPCRاست. برای کمی‌سازی مطلق خاص اسید نوکلئیک ویروسی توسطqPCR، یک منحنی استاندارد نیاز است. این منحنی‌های استاندارد با رقیق‌سازی نمونه با غلظت شناخته شده به دست می‌آیند. تولید منحنی استاندارد به شدت تحت تاثیر خطاهای متفاوت از آزمایشگاه به آزمایشگاه و روز به روز است. از آنجا که کمی‌سازی مطلق توسطddPCRنیازی به منحنی کالیبراسیون ندارد، محدودیت‌های آن را ندارد. باید توجه داشت که کمی‌سازیRNAباRT-dPCRباید به یک نمونه مرجع استاندارد شود.ddPCR  از همان پرایمرها، پروب‌ها، پلیمرازTaqو مواد واکنشی به عنوان   PCR سنتی برای تکثیر قطعهDNAهدف استفاده می‌کند، اما حساسیت و تکرارپذیری آن بیشتر است.

محفظه‌سازیDNAهدف نسبت سیگنال به نویز را با تکثیر سیگنال‌های ژن هدف نسبت به سایر ژن‌ها بهبود می‌بخشد. در واکنش هایPCRعادی، مهارکننده‌ها یاDNAپس‌زمینه اضافی (نویز) می‌توانند بر کارایی تکثیر تأثیر بگذارند. درddPCR، کمی‌سازی مطلق با شمارش تعداد قطره‌های فلورسنت مثبت و منفی به دست می‌آید، اما درqPCR، به عنوان یک سیستم آنالوگ، سیگنال فلورسنت متناسب با مقدارDNA تکثیر شده افزایش می‌یابد. از آنجا کهPCRقطره‌ای یک اندازه‌گیری نقطه پایانی است، وابستگی کمتری به کارایی واکنش نسبت به روش‌هایqPCRدارد.

کلام آخر:

در این مقاله، دو تکنیکDigital PCRوReal time PCRکه امروزه به عنوان مهم ترین تکنیک های مولکولی جهت تشخیص انواع بیماری ها در آزمایشگاه های ژنتیک و مولکولی هستند، برای شما معرفی شدند و شما را با پرکاربردترین دستگاه هایdPCRوqPCRنیز آشنا کردیم. جهت دریافت مشاوره تخصصی و خرید این دستگاه ها می توانید با کارشناسان وبسایت ماناتک که به عنوان شرکت تجهیز آزمایشگاه مولکولی شناخته شده اند در ارتباط باشید